La rosuvastatina 94

+

TRANSPORTE dependiente de ATP de la rosuvastatina en la membrana VESÍCULAS EXPRESAR EL CÁNCER DE MAMA resistencia a la proteína Liyue Huang Yi 1. Wang y Scott Departamento de Metabolismo y farmacocinética de drogas, AstraZeneca Pharmaceuticals LP, Wilmington, Delaware Correspondencia: Grimm: Dr. Yi Wang, Departamento de Drug Metabolism y farmacocinética, AstraZeneca Pharmaceuticals LP, Wilmington, dE 19850. e-mail: yi. wang astrazeneca. com Resumen MDR1 / ABCB1, MRP2 / ABCC2, y proteína de resistencia del cáncer de mama (BCRP) / ABCG2 se expresan en el hígado y el intestino y contribuir a la disposición de muchos fármacos. La rosuvastatina, un inhibidor de reductasa 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA para el tratamiento de pacientes con dislipidemia, se excreta principalmente a través de la bilis como fármaco inalterado. El presente estudio fue diseñado para determinar si la rosuvastatina es transportado por MDR1, MRP2, y BCRP. El valor de permeabilidad aparente para rosuvastatina través de las células de riñón canino Madin-MDR1-Darby fue baja (8 nm / s), y no se observó transporte direccional. la absorción de rosuvastatina en las membranas y las membranas Sf9 de control que expresan MRP2 fue similar en presencia o ausencia de GSH. Por el contrario, ATP estimuló drásticamente la absorción de rosuvastatina en las membranas que expresan BCRP, pero no controla membranas. transporte rosuvastatina tuvo lugar en un espacio osmóticamente sensible y era saturable. Un análisis de Eadie-Hofstee sugirió que había dos sitios de transporte de BCRP, con una aparente K m de 10,8 M para el sitio de alta afinidad y 307 M para el sitio de baja afinidad. Estos datos demuestran que la rosuvastatina es transportado de manera eficiente por BCRP y sugieren que BCRP juega un papel importante en la disposición de rosuvastatina. Un número de ATP vinculante cassette transportistas (ABC) se expresan en las membranas canalicular de los hepatocitos y las membranas de borde en cepillo de los enterocitos incluyendo la P-glicoproteína (Pgp) (MDR1 / ABCB1), la proteína de resistencia a múltiples fármacos 2 (MRP2 / ABCC2 ), y la proteína de resistencia de cáncer de mama (BCRP / ABCG2), que también se conoce como la proteína de resistencia a mitoxantrona (MXR). Estos transportadores de flujo de salida tienen distintos, pero superpuestos, especificidad de sustrato y se han demostrado estar involucrados en la excreción biliar de muchos fármacos (Sasabe et al. 1998 Jonker et al. 2000). MDR1 Pgp, que se sobreexpresa en células tumorales resistentes, transporta una gran variedad de fármacos hidrófobos, tales como daunorubicina, vinblastina, y loperamida (Hochman et al., 2002). MRP2 se ha demostrado que el transporte de muchos conjugados de glutatión S-glucurónido y sulfato. Además de los conjugados, MRP2 transporta algunos aniones orgánicos no conjugados incluyendo metotrexato, irinotecan, y ampicilina (Gerk y Vore, 2002). El gen de BCRP se ha clonado y se encontró que el producto de la proteína a ser un medio-transportador, que consiste en un péptido de seis transmembrana único 70-kDa. Compuestos estructuralmente diversos, tales como antraciclinas, mitoxantrona, metotrexato, las camptotecinas, y estrona-3-sulfato se han identificado como sustratos BCRP (Sarkadi et al. 2004). La rosuvastatina es un inhibidor de reductasa 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA para el tratamiento de pacientes con dislipidemia. La biodisponibilidad absoluta de la rosuvastatina se estimó como 20, con una relación de extracción hepática estimado de 0,63 (Martin et al. 2003a). Metabolismo de la rosuvastatina parece ser una vía menor de eliminación en los seres humanos, y rosuvastatina se excreta principalmente en la bilis como padre. En un estudio equilibrada masa humana, 90 de la dosis se recuperó en las heces, principalmente (92) como fármaco inalterado (Martin et al., 2003b). Las estatinas, incluyendo la rosuvastatina, pitavastatina, cerivastatina, y pravastatina son sustratos para OATP-C (OATP1B1), un polipéptido transportador de aniones orgánicos expresada exclusivamente en la membrana basolateral de los hepatocitos (Hsiang et al. 1999 Shitara et al. 2003 Hirano et al. 2004 Schneck et al. 2004). Se ha demostrado que las estatinas son sustratos para múltiples transportadores de salida. La atorvastatina, cerivastatina, simvastatina y se han informado de que los sustratos de Pgp (Hochman et al. 2004 Kivisto et al. 2004). La pravastatina parece ser un sustrato de MRP2. transporte dependiente de ATP de pravastatina se ha demostrado en las membranas canaliculares aislados de ratas, y la excreción biliar de pravastatina se reduce en ratas Mrp2-mutantes (Yamazaki et al. 1997). El transporte de pravastatina en el (BA)-basal a apical dirección es 2,5 veces mayor que en la dirección apical a basal (AB) a través de Madin-Darby de riñón canino monocapa (MDCK) que expresan tanto OATP-C y MRP2 ( Sasaki et al. 2002). Estudios recientes indican que varias estatinas también son transportados por BCRP in vitro (Hirano M et al. 2005 Matsushima et al. 2005). El presente estudio fue diseñado para determinar si la rosuvastatina es un sustrato para MDR1, MRP2 o BCRP. Los resultados indican que la rosuvastatina es transportado de manera eficiente por BCRP en vesículas de la membrana, y sugieren que BCRP puede jugar un papel importante en la disposición de rosuvastatina. Materiales y Métodos Materiales. La rosuvastatina fue suministrado por AstraZeneca Pharmaceuticals LP. GF120918 se obtuvo de GlaxoSmithKline (Research Triangle Park, Carolina del Norte) en virtud de un acuerdo de transferencia de material. 3 HEstradiol-17-- d glucurónido (E 2 17G) se adquirió de PerkinElmer (Boston, MA). 3 HRosuvastatin fue suministrado por GE Healthcare (Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido). Otros productos químicos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). reactivos de cultivo celular se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). células de riñón canino Madin-Darby transfectadas con MDR1 humana (MDR1-MDCK) se obtuvieron del Instituto Holandés del Cáncer (Amsterdam, Países Bajos). Transwells (12 pocillos, diámetro 11 mm, 0,4-m poros) se adquirieron de Corning Costar (Cambridge, MA) membranas de MRP2-Sf9-VT (membranas aisladas de células Sf9 que expresan transporte MRP2 dependiente de ATP de 200 nM 3 Hleukotriene C4 WAS / mg de proteína / min), membranas CTRL-Sf9 (membranas de control de 20,8 pmol aislados a partir de células Sf9 que expresan galactosidasa), membranas MXR-M-VT (membranas aisladas de células de mamífero que expresan BCRP transporte dependiente de ATP de 100 M 3 Hmethotrexate era 172,6 pmol / mg de proteína / min), y las membranas CTRL-M (membranas de control aisladas a partir de células de mamífero que no tienen expresión BCRP) se adquirieron de Solvo Biotecnología (Budapest, Hungría). Monocapa Estudios de efusión. células MDR1-MDCK se cultivaron y se llevaron a cabo experimentos de transporte como se describe por Polli et al. (2001). Brevemente, las células fueron cultivadas en Dulbecco Modificado Medio Eagles suplementado con suero bovino fetal 10 en ausencia de cualquier antibiótico o agentes de selección. Las células se sembraron sobre Transwells a una densidad de 300.000 células / cm 2. y medio se reemplazó diariamente y se llevaron a cabo 2 h antes de los experimentos de transporte. Las monocapas se utilizan para estudios de transporte de 3 días después de la siembra. Los compuestos se disolvieron en dimetilsulfóxido y después se diluyó en tampón de Hanks equilibrada transporte (pH 7,4) (Mediatech, Herndon, VA). La cantidad de sulfóxido de dimetilo en la solución final fue de transporte (v / v). Menos de 0,5 compuestos rosuvastatina y de referencia se ensayaron por triplicado durante 60 min en un baño de agua 37 ° C agitando. concentraciones de rosuvastatina fueron analizados por chromatographytandem líquido espectrometría de masas usando un Sciex API 3000 con fuente de pulverización Turboion (Applied Biosystems / MDS Sciex, South San Francisco, CA) (Schneck et al. 2004). Las concentraciones de eritromicina y propranolol se determinaron por cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem utilizando un Micromass Quattro Ultima (Micromass UK Ltd, Cheshire, Reino Unido), equipado con una interfaz de ionización por electrospray. Se cargaron las muestras (volumen de inyección 1.020 l) en las columnas por medio de un inyector automático HTS PAL (CTC Analytics AG, Zwingen, Suiza). La cromatografía se realizó en columnas de Synergi MAX-RP 30 2,0 mm, 4 m (Phenomenex, Torrance, CA) a una velocidad de flujo de 1,5 ml / min. La fase móvil consistió en dos disolventes: 0,1 ácido fórmico en agua (A) y 10 metanol en acetonitrilo (B). El perfil de gradiente fue 0 a 0,3 min 0 B, 0,3-1,3 min gradiente lineal hasta 95 B, 1.3 a 1.6 min 95 B, y de 1,6 a 2 min 0 B. La permeabilidad aparente (app P) valores se calcularon utilizando la ecuación P aplicación (1 / AC 0) (dQ / dt), donde a es el área de superficie de la membrana, C 0 es la concentración de fármaco de donantes en t 0, y dQ / dt es la cantidad de fármaco transportado dentro de un período de tiempo dado. aplicación relación de flujo P (BA) / P aplicación (AB). La rosuvastatina transporte en vesículas de membrana. transporte dependiente de ATP de 3 Hrosuvastatin o 3 HE 2 17G, un sustrato conocido de MRP2, se midió utilizando una técnica de filtración rápida (Huang et al. 2000). Brevemente, las membranas se descongelaron rápidamente a 37ºC. Transporte fue iniciada por la adición de membranas (3066 g) a la memoria intermedia preincubado (50 mM Tris, 50 mM de manitol, y MgCl2 10 mM. PH 7,5) que contiene ATP 5 mM o AMP y 3 Hrosuvastatin o 3 HE 2 17G. Transporte se terminó mediante la adición de 2,5 ml de búfer de transporte enfriado con hielo, y asociada a vesículas 3 Hrosuvastatin se separó del libre 3 Hrosuvastatin por filtración rápida a través de un GF / F de filtro (Whatman, Florham Park, NJ). Los filtros se lavaron adicionalmente dos veces con 2,5 ml de tampón enfriado con hielo y se ensayaron para determinar la radiactividad en 10 ml de cóctel de centelleo líquido. Debido a que la unión no específica al filtro fue relativamente mínimo, los datos no fueron corregidos para la unión al filtro menos que se indique lo contrario en la leyenda de la figura. transporte dependiente de ATP se determinó como la diferencia en la absorción entre ATP 5 mM y AMP 5 mM. Estadística. Las diferencias estadísticas (p 0,05) se determinaron por análisis de varianza de una sola vía, seguido por una prueba de comparación o estudiantes no apareados prueba t múltiple. software Prism 3.0 (GraphPad Software Inc. San Diego, CA) se utilizó para producir las curvas de mejor ajuste. Resultados Pgp mediada Transporte de rosuvastatina. el transporte a través de monocapas rosuvastatina MDR1-MDCK se midió a concentraciones de 10 y 50 M en presencia o ausencia de 2 M GF120918, un potente inhibidor tanto para Pgp y BCRP. La rosuvastatina transporte en ambas direcciones BA y AB fue similar, con un valor de p aplicación de 8 nm / s, y no fue afectada por GF120918. En contraste, el transporte de la eritromicina sustrato Pgp (10 M) en la dirección BA era 35 veces mayor que en la dirección AB (Tabla 1).